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    色谱分析基本原理

    放大字体  缩小字体 发布日期:2005-10-07  浏览次数:8599
    色谱分离是色谱体系热力学过程和动力学过程的综合表现。

        热力学过程是指:与组分在体系中分配系数相关的过程;

        动力学过程是指:组分在该体系两相间扩散和传质的过程。

        组分、流动相和固定相三者的热力学性质使不同组分在流动相和固定中具有不同的分配系数,分配系数的大小反映了组分在固定相上的溶解-挥发   吸附-解吸的能力。

        分配系数大的组分在固定相上溶解或吸附能力强,因此在柱内的移动速度慢;分配系数小的组分在固定相上溶解或吸附能力弱,因此在柱内的移动速度快。

        经过一定时间后,由于分配系数的差别,使各组分在柱内形成差速移行,达到分离的目的。

    . 分配过程

        在色谱分配过程中,假设考虑柱内极小一段的情况:

    色谱主柱内的分配平衡

    在一定温度、压力下,组分在该一小段柱内发生的溶解-挥发或 吸附-解吸的过程称为分配过程。

    1. 分配系数 Kdistribution coefficient):

        分配系数也称为平衡常数。是指在一定的温度和压力下,在两相之间达到平衡时,组分溶解在固定相中的平均浓度与其在流动相中的平均浓度之比。

                                        (7)

    式中:cL为组分在固定相中的平均浓度;

          cG为组分在流动相中的平均浓度,

          K — 是一个无因次量,它是由组分及固定液的热力学性质决定的,只随柱温和柱压而变化,与色谱柱中气相和液相的体积无关。 

        分配系数K是气一液分配色谱中的重要参数。如果两个组分的分配系数相同,则它们的色谱峰完全重合;反之,分配系数相差越大,相应的色谱峰相距越远,分离越好。

     2. 分配比 kpartition ration):

    又称容量因子。即在一定的温度和压力下,组分在两相间达到分配平衡时,组分在固定相和流动相中的质量比:

               (8)

     式中:p组分在固定相中的质量,q组分在流动相中的质量。

     3. 分配系数(K) 和分配比 k 的关系:

        Vs为固定相的体积,Vm为流动相的体积,则上式可写成:

                               (9)

    Vm——为柱内流动相的体积,也称为柱的死体积:包括固定相颗粒之间和颗粒内部空隙中的流动相体积;

    Vs——为固定相的体积,它指真正参与分配的那部分体积:若固定相是吸附剂、固定液、离子交换剂或凝胶,则分别指吸附表面积、固定液体积、离子交换剂交换容量或凝胶孔容。

    b ——为色谱柱的相比

     4. 分配系数 K 和分配比 k 与保留值 tR 的关系:

        分配平衡是在色谱柱中固定相和流动相之间进行的,因此分配比也可以用组分在固定相和流动相中的停留时间之比来表示,则分配比可写成:

                       (10)

        任一组分的 k 值可由实验测得,即为调整保留时间 tR与不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间t0 的比值。可将k 看作色谱柱对组分保留能力的参数,k 值越大,保留时间越长

    分配系数 K 与保留时间的关系为:

    tR’= k t0 =K t0  Vs/Vm                           (11)

         由此式可见,在一定的实验条件下,组分的调整保留时间正比于分配系数 K(或分配比 k),K(或 k)越大,组分在色谱柱内的保留时间越长。由于分配系数(或分配比)是由组分的性质决定的,因此保留值可用于定性。在填充色谱柱中,选择不同的固定液及其用量,可以控制组分在色谱柱上的保留值。

        综上所述,在色谱分析中要使两组分分离,它们的保留时间t必须不同,而t是由两组分的 K k 决定,

        所以待分离组分K k 不同是色谱分离的先决条件。

        色谱峰间距离由分配系数决定,即与色谱的热力学过程有关;

        色谱峰的宽窄由组分在色谱柱内的传质和扩散行为决定,即与色谱的动力学过程有关。

        色谱理论可分为热力学及动力学理论两方面:

    热力学理论是由相平衡观点来研究分离过程 ——塔板理论;

    动力学理论是以动力学观点速度来研究各种动力学因素对柱效的影响

    ——速率理论。

    二.塔板理论

        亦称为平衡理论。以气一液色谱为例:将气一液色谱的分离过程看成组分在固定液中的分配平衡过程。

     1.塔板理论 

        塔板理论把色谱柱比作~个分馏塔,塔板的概念是从分馏中借用来的,实际上色谱柱中并无塔板,只是引用了处理分馏过程的概念和理论来解释色谱的分离过程。

        塔板理论把色谱柱想象成由许多塔板组成,在每一个塔板内,一部分空间为涂在担体上的液相占据,另一部分空间充满载气,载气所占据的空间体积称为板体积。组分随载气进入色谱柱后,在两相间进行分配。

    塔板理论假设:

    1)在色谱柱中的每一个小段长度H内,组分可以迅速在气液两相间达到分配平衡,这一小段称为理论塔板(实际在柱内不存在),其长度称为理论塔板高度,简称板高,以H表示。

    2)载气不是连续流过色谱柱,而是脉冲式(间歇式),每次通过一个塔板体积。

    3)样品都加到第1块塔板上,且组分沿色谱柱(纵)向扩散可以忽略不计。

    4)某一组分的分配系数在所有塔板上是常数。

        根据上述假设,试样由载气带进色谱柱,与固定液接触而被溶解,在每个塔板高度内被分离的组分在气相和液相之间达成一次分配平衡,随着载气的不断进入,被溶解的组分又从固定液中挥发出来,挥发出来的组分随载气向前移动又再次被固定液溶解。经过若干个塔板即经过溶解一挥发的多次反复分配(103106次),待分离组分由于分配系数不同而彼此分离,分配系数小(挥发性大)的组分首先由色谱柱中流出,显然,当塔板数足够多时,即使分配系数差异微小的组分也能得到良好的分离效果。  

    2. 柱效能指标(nH )——可以由塔板理论导出

    1理论塔板数 (n)柱长 (L)一定时n 越大,柱效就越高:

         经验公式                             (12)

    式中:tRWh/2Wb应该采用同一单位(时间或长度)

    2理论塔板高度(H )设色谱柱长为L,则理论塔板高度

                                (13)

      由此可见:色谱峰越窄即Wh/2 Wb 越小,理论数塔板 n越大,对给定长度的色谱柱而言,塔板高度 H 越小,组分在柱内被分配的次数愈多,则柱效越高。因此 n H 可作为描述柱效能的指标。

    3有效(理论)塔板数neft

        在实际应用中,常常出现计算出的n虽然很大,但色谱柱的效却不高,这是由于保留时间tR中包含了死时间t0,而t0并不参加柱内的分配过程,因此理论塔板数和理论塔板高度并不能真实地反映色谱柱分离效能的好坏。为此,提出

      用有效塔板数neft 和有效高度Heft评价柱效能的指标,即:

                     (14)

    4有效塔板高度  Heft           

                              (15)

      物质在给定色谱柱上的neft越大,说明该物质在柱中进行分配平衡的次数越多,对分离有利,但不能表示该物质的实际分离效果。是否能在色谱柱上分离,主要取决于各组分在两相间分配系数 K 的差异。如果两组分在同一色谱柱上的分配系数相同,无论 neft 有多大,这两种组分也无法被分离开.

         塔板理论在解释色谱图的形状,计算 n H方面是成功的。但其某些基本假设不完全符合色谱的实际情况(如 K 和组分的量无关、组分在两项中分配能迅速达到平衡、纵向扩散可以忽略等)。塔板理论只能定性地给出塔板高度的概念,而未能找出影响板高H的因素,也就更无法提出降低板高的途径;这主要是由于塔板理论没有考虑到动力学因素对色谱分离过程的影响。

    三.速率理论

        1956 Van  Deemter 等人在塔板理论的基础上,提出了关于色谱过程的动力学理论——速率理论。

        该理论仍然采用塔板高度的概念,但同时考虑到H还取决于同一组分的不同分子在柱中差速迁移过程中所引起的色谱蜂扩展程度,将色谱过程与组分在两相间的扩散和传质过程等动力学因素联系起来,从理论上总结出影响塔板高度的各种因素,

    导出H与其影响因素之间的关系式:

                         (16)

    式中:ABC 在一定实验条件下为常数;u为载气的线速度(cms

        速率理论综合考虑了柱内影响板高的三种动力学控制过程(使谱带扩展的因素归纳成三项)——涡流扩散项 A、纵向分子扩散项Bu和传质阻力项Cu;欲降低H,提高柱效,需降低这三个塔板分量,各项的物理意义如下:

     1涡流扩散项 Aeddy diffusion 

        当色谱柱内同时起步的组分随流动相进入色谱柱朝柱口方向移动时,如果固定相颗粒大小及填充不均匀,组分分子穿过这些空隙时碰到大小不一的颗粒而必须不断改变流动方向,使组分分子在柱内形成了紊乱的涡流,不同的组分

    分子所经过的路径长短不一,组分分子或前或后流出色谱柱,造成色谱峰的峰形扩张。

                         A = 2l dp

    l填充不规则因子;dp固定相颗粒平均直径;

    3 涡流扩散使峰展宽

    涡流扩散项A与填充物的平均直径dp 和固定相填充不均匀因子l又有关。采用粒度较细,颗粒均匀的担体,尽量填充均匀可以降低涡流扩散项,降低板高H,提高桂效。但在气相色谱中,粒度很小时,柱阻大,且不易填匀因此一般采用粒度为

    60-80目或80-100目的填充物较好。(空心毛细管柱的A项为零)

    2纵向分子扩散项 molecular  diffusionBu 

        当试样分子以塞子的形式进入色谱柱后,随流动相在柱中前进时,由于存在浓度梯度,组分分子自发地向前和向后扩散即沿着色谱柱轴向扩散,这种扩散称为纵向分子扩散,结果使色谱峰扩张,板高H增大。

                                   B = 2 g Dm

    Dm组分在流动相中的扩散系数cm2/s),与流动相的相对分子量平方根成反比 Dm 1/M1/2;与柱温成正比,与柱压成反比。在液相色谱中,由于主分在液体中的扩散系数很小(气体中的1/105)此项可忽略不计。

    g弯曲因子,亦称阻碍因子,由于固定相颗粒的存在使扩散受阻,填充柱<1,硅藻土单体为0.50.7,毛细管柱=1

    措施:选择分子量较大的载气(如N2)、较低的柱温、较高的u以减小Bu

    纵向分子扩散使峰展宽

    (a)柱内谱带浓度分布构型;(b) 相应的相应信号

    3.传质阻力项resistance to mass transferCu

          试样组分的分子在两相中进行溶解、扩散、分配时的质量交换过程,称为传质过程;在传质过程中所受到的阻力叫传质阻力。它包括气相传质阻力和液相传质阻力,即:

                                    C u =Cm+C su

    式中 Cm流动相传质阻力,指试样组分从流动相扩散到流动相与固定相界面进行质量交换过程中所受到的阻力;

         Cs固定相传质阻力,为组分从两相界面扩散到固定相内部达到分配平衡后又返回到两项界面时受到的阻力。

    Cmu:组分分子进入色谱柱后,从流动相扩散到两相界面需要一定的时间。该时间与扩散是经过的距离平方成正比,与组分的Dm成反比;而扩散经过的路径决定于固定相颗粒间空隙的大小,即决定于dp的大小。由于组分处在颗粒空隙间的不同位置,因此到达两相界面的时间不同,从而使谱带展宽:

                            

    式中:w由柱填充性决定的因子;Dm组分在流动相中的扩散系数。

        由此可见: Cmu与扩散是经过的距离平方成正比,即决定于dp的大小;

    与组分扩散系数成反比。

        因此:采用细颗粒的流动相、增大Dm、适当降低流动相线速度等均可使流动相传质阻力减小。   

    组分在流动相中的传质

    Csu:组分分子从两相界面扩散到固定液内部,在固定液中消耗的时间不同,达分配平衡后又返回到两相界面所需时间不同,使色谱带展宽:

    式中:q与固定相性质有关的因子,均匀液膜 q2/3df液膜平均厚度; Ds组分分子在固定液中的扩散系数。

    固定相传质对谱带展宽的影响

    (a)两相达平衡;(b)达平衡后的瞬间内

        固定相传质速度受组分在固定相内扩散速率的控制,且固定液含量低,df 小,组分在固定液内扩散的时间缩短,有利于分配平衡的建立,但含量过低,易使载体表面的活性中心暴露,造成峰拖尾现象。

    4.速率理论方程:综合上述各塔板高度分量,则:

             (17)

       此即范特姆特(Van Deemter)方程,即速率方程式。

      当除u以外的参数都视作常数时,Van Deemter 方程可简写为:

              (18)

    速率理论概括了涡流扩散、分子扩散和传质阻力对塔板高度的影响,指出了影响柱效能的因素,对色谱分离条件的选择具有指导意义。

    5. 影响色谱带展宽的其他因素

    1 非线性色谱

        速率理论虽然比较全面地考虑了两相中的传质和扩散但仍假定等温线是线性的事实上等温线经常是非线性的特别在吸附色谱中由于等温线的非线性决定了分配系数不是常数而是浓度的函数使谱带的高浓度区域 ( 中心附近 ) 和低撤度区域 ( 前沿和尾部 ) 的分子的移动速率不等造成色谱峰 " 拖尾 " " 伸舌 " 现象从而使峰展宽

    2活性中心的影响

        由于载体表面不完全惰性即使涂布少量固定液后在它表面存在的活性中心 (如酸或碱作用中心) 对极性强的组分仍会产生吸附使这些组分释放的速度慢于 其他分子而造成拖尾解决办法是将载体预处理除去或减少这些活性中心

    3 柱外效应

        在色谱柱以外的某些因素使谱带展宽降低柱的实际分离效率的现象称为外效应造成柱外效应的因素有两类柱前后死体积和与进样有关的技术

        前者包 括较大的气化器体积、连接管体积和检测器死体积等后者严括进样速度慢量大及气化温度不够高等这些因素对组分在两相中的分配系数不起任何作用反而使组分初始带宽增加加剧分子扩散造成谱带展宽因此必须将柱外效应抑制到最低程度

    . 色谱分离条件

    1.分离效果指标

    1)柱效能                             

              neft↑→ 分配平衡次数 越有利于分离

    2)选择性

         neft 大,有利于分离,但两个色谱峰不一定能分开,能否分离取决于组分在固定相中 的差异,以选择性表示:

                                           (19)

         r21 ↑→ 分离的可能性越大,无因次量,随固定相及柱温的变化而变化。

     2. 总分离效能指标:分离度(又称为分辨率) ——对两色谱峰分离程度的量度。 

        为了综合考虑保留值的差值与峰宽两方面因素对柱效率的影响,以分离度作为色谱蜂的总分离效能指标:

                      (20)

    分离度 R 定义为:相邻二组分的色谱峰保留值之差与峰宽总  和的一半的比值。

    式中:分子为两组分保留值之差由色谱体系热力学过程决定;

          分母为两峰宽度之和一半取决于色谱体系动力学过程;

    当峰形不对称或相邻两峰间有重叠时,峰宽度 Wb 测量较困难,此时可用半峰宽代替峰宽:

                        (21)

    (以上两式不完全相等,但差别很小)

    分离度R的值越大,说明相邻两组分分离效果越好。

    对一般分析要求R1~1.5之间。  

    3. 基本分离方程(neftr21kR 之间的关系) 

     对于两个相邻的色谱峰,假设峰底宽度相等,可推导出:

                (22)

                            柱效因子  相对分离因子 保留程度因子

       (式中:n2为组分2的理论塔板数。)

        上式称为色谱分离的基本方程式。它清楚地表明了分离度R、理论塔板 n、相对保留值 r2l 以及分配比(容量因子)k 之间的关系。

    1)柱效的影响

         分离度 R 与塔板数 n 的平方根成正比,增加 n,可以增加R。但若通过增加L来增加 n,会延长分析时间,所以降低塔板高度H是增大分离度的有效途径。实际工作中,为达到所需的分离度,根据下式可计算出给定分离度下应具有的塔板数:

                       (23)

    2)分配比的影响   

        增大分配比 k 也可以增加分离度 Rk 是由组分色谱峰和空气峰的相对位置决定的,它与固定相含量和流动相性质及温度有关。

    增加固定液用量虽可增大分离度,但会延长分析时间,引起色谱峰展宽)

    3)相对保留值的影响    

            r12(与固定相有关)增大,可使分离度增大。r12 是由相邻两色谱峰的相对位置决定的,决定于固定相和流动相的性质。在气相色谱法中:通过改变固定相来改善r12值(流动相惰性);在液相色谱法中:通过改变流动相来改善r12值(固定相昂贵)。(当 r12=1 时,无论柱效有多高,R 为零,两组分不可能分离)

                        (24)

     
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