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    产气荚膜梭菌及检验

    放大字体  缩小字体 发布日期:2010-09-01  浏览次数:8668
    核心提示: 一、流行病学  产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌,是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由

    一、流行病学

      产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌,是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。摄食被本菌污染的食品后8&#0;22小时开始发病。在食品中该菌数量必须达到很高时(1.0×107或更多),才能在肠道中生产毒素,病程通常在24小时内,但某些个体的不显著症状可能会持续1&#0;2周,已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。

      据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒,在美国占细菌性食物中毒的30%左右,另据美国疾病控制中心,估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人,其中大约只报导1200例,暴发约20起,大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。例如:学校的自助食堂和护理病房,产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。

      产气荚膜梭菌广泛分布于环境中,经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中,从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜,炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌,引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物,牛奶也可因污染而引起中毒,原因是因为食品加热不彻底,使芽胞在食品中大量繁殖所致,此外不少熟食品,由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中,细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素,其食品并不一定在色味上发现明显的变化,人们在误食了这样的熟肉或汤菜,就有可能发病。

      产气荚膜梭菌易于形成芽胞,芽胞的热抵抗力很强,由患者粪便中分离的芽胞能耐受100℃,1&#0;5小时的加热。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外,生化性状,毒素及酶的特异性等,同其它魏氏梭菌是一致的。

      当产品达到合适温度时,那些未被杀死的芽胞,由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中,产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品,特别当做好的食品量又是很大时,适当的热处理(60℃以上)充分的再加热,冷却食品(最低中心温度为24℃)也是必要的控制措施,培训食品加工人员,仍是控制措施的一个关键方面。

    二、生物学特性:

    1、形态:

      本菌菌体两端钝圆,直杆状1-2×2-10μm,革兰氏阳性,卵圆形芽胞位于菌体中央或近端,不比菌体明显膨大,但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞,无鞭毛,在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。

    2、培养:

      本菌虽属厌氧性细菌,但对厌氧程度的要求并不太严,甚至在EH=200-250mv的环境内也能生长。

      在普通培养基上能生长,若加葡萄糖,血液,则生长更好。生长适宜温度为37-47℃,多认为43-47℃为最宜本菌生长和繁殖速度极快,在适宜条件下增代时间仅8min,可利用高温快速培养法,对本菌进行选择分离,如在45℃下,每培养3-4小时传种1次,即可较易获得纯培养,在深层葡萄糖琼脂中大量产气,致使琼脂破碎,在牛奶培养基中,可见到暴裂发酵,在庖肉培养基中培养数小时即可见到生长,产生大量气体,肉渣或肉块变为略带粉色,但不被消化。

      在普通琼脂平板上培养15小时左右可见到菌落,培养24小时菌落直径2&#0;4mm,呈凸面状,表面光滑半透明,正圆形,在营养成分不足或琼脂浓度高的平板上,有时尤其经过传种的菌株,可能形成锯齿状边缘或带放射状条纹的R型菌落。

      在含人血、兔血或绵羊血的琼脂平板上培养的菌落周围有双层溶血环,内层溶血完全,外层溶血不完全,好似靶状。

      在乳糖、牛奶、卵黄琼脂平板上培养的菌落周围出现乳光浑浊带。此反应能被本菌α抗毒素抑制。由于发酵乳糖菌落周围的培养基颜色发生变化(中性红指示剂呈粉红色)不消化牛奶,不分解游离脂肪,菌落周围不出现透明环及虹彩层。

    3、生化特性:

      所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖,产酸产气,液化明胶,不产生靛基质,还原硝酸盐为亚硝酸盐,但也有例外。能将亚硫酸盐还原为硫化物。在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。发酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固,同时由于大量产气凝块碎裂,所谓暴力发酵,这是本菌的主要生化特征之一,也是主要鉴别的指标。G+C克分子百分比为24-27%。

      产生卵磷脂酶(磷酸酶C)分解卵磷脂为磷酰胆碱与非水溶性甘油二酸酯,上述卵黄琼脂平板菌落周围出现的乳光浑浊带即属本反应。

    4、毒素:

      (1)、外毒素:各型产气荚膜梭菌产生的外毒素(或可溶血抗原)共有12种,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素与人类食物中毒有关。

      (2)、肠毒素:A型产气荚膜梭菌的耐热株能引起人的食物中毒,关于产气荚膜梭菌食物中毒的发病机制,基本认为是,被耐热性A型产气荚膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,虽经烹制加热,但芽胞不仅不死灭,反而由于受到〝热刺激〞,在较高温度长时间储存(即缓时冷却)的过程中芽胞发芽,生长,繁殖,而且随食物进入人肠道的这些繁殖体容易再形成芽胞,同时产生肠毒素,聚集于芽胞内,当菌体细胞自溶和芽胞游离时,肠毒素将被释放出来,人、猴、狗等口服人工提取的该肠毒素能引起腹泻。

      人和动物对产气荚膜梭菌的毒素的免疫主要表现为抗肠毒素的产生,健康者血清常含有抗肠毒素,似乎表明产气荚膜梭菌作为正常菌群,在肠道内可能在不断地产生着肠毒素。

    三、检验方法:

    1、样品的储存和运送:

      如样品不能立即进行检验时,应在样品中加等量缓冲甘油--氯化钠溶液(液体食品应加双料的),将样品做低温保存,直到检验,运送样品时,应使样品保持冷冻状态,并要避免容器消损。

    2、将解冻样品取25g移入灭菌的均质杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速搅拌1-2分钟,使之均质化,作为1:10稀释液,以上1:10稀释的均质液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀释液,(如为液体样品则可吸取25mL加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释并摇匀,再作10倍递增稀释即可)。

      倾注不含卵黄的TSC琼脂倒10个灭菌平皿中,每皿约5mL,并迅速旋转平皿,使琼脂凝固后,将每个平皿编号标记,以无菌操作,吸取稀释样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心,再向平皿倾注不含卵黄的TSC琼脂15mL,缓慢地旋转平皿,使其与接种物混合均匀.也可用灭菌L棒,将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于不含卵黄乳液的TSC琼脂上,将平板水平静置5-10分钟,使接种物被吸收,然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层,琼脂凝固后,将平板置于厌氧罐内于36+1℃,培养20小时,取出平板,用肉眼观察生长情况和有无黑色菌落,挑选有20-200个黑色菌落的平板进行记数,产气荚膜梭菌的菌落一般呈黑色。

    3、证实:

      从可记数的平板(具20-200个菌落)中挑选10个典型菌落,分别接种到液体硫乙醇酸钠培养基试管中,于36±1℃,培养18-24小时,取培养物涂片,作革兰氏染色镜检,检查培养物的纯度和细菌形态,产气荚膜梭菌为革兰氏阳性,粗短的梭状芽胞杆菌.对于被污染的培养物可划线接种在含有卵黄的TSC琼脂平板上,于厌氧条件下以36±1℃,24小时培养,以获得纯培养物。

      上述培养物,以接种针穿刺接种动力,硝酸盐培养基36±1℃厌氧培养24小时观察有无动力,滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL,观察硝酸盐是否被还原,取生长旺盛的硫乙醇酸钠培养液1mL接种含铁牛奶培养基,厌氧培养过夜或46℃2-5小时观察有无暴烈发酵现象,但培养基不变黑,将培养液点种卵黄琼脂平板(每个平板至少可点种10点),倒置厌氧培养装置内36±1℃培养24小时,观察接种点,产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,使接种点的底部及周围形成乳白色的浑浊带.此外还可作明胶液化及含1%水杨甙和含1%棉子糖的发酵试验等,对上述四项主要生化试验,全部符合者即可确定为产气荚膜梭菌。

    4、结果解释及报告:

      样品中产气荚膜梭菌的计算,基于被证实为产气荚膜梭菌菌落的百分数(例如10‐4稀释的平板中,平均有85个菌落,10个菌落中,有8个被证实为产气荚膜梭菌,那么每1g食品中产气荚膜梭菌数即为85×(8/10)×10000=680000),报告产气荚膜梭状芽胞杆菌数/g(mL) 。

     

    产气荚膜梭菌检验检测程序

    检样25g(mL)或稀释液225mL

    TSC琼脂混合倾注

    黑色菌落记数

    任挑黑色菌落10个,分别接种FT培养基

    确证试验

     

    镜 动 销 牛 卵

    检 力 酸 奶 磷

    形 试 盐 发 脂

    态 验 还 酵 分

      原  

    菌落计数

     

    四、培养过程中芽胞形成和肠毒素的产生:

      假如对分离的菌株,直接测试芽胞和肠毒素,应在硫乙醇酸盐肉汤中继续培养,如上述,将储存培养物移至其它实验室作测试时,必须先将其移种至Difco公司生产的熟肉培养基中,并于35℃培养24小时,然后再置于室温中24小时,并将此熟肉培养物放置在4℃保存。

      用旋转混合熟肉培养物,并分别各移种0.5mL至2支含10mL新鲜经杀菌的液体硫乙醇酸盐培养基中,将其中1管置于有水的烧杯中,或在水浴中加热75℃10分钟,于35℃培养18小时,另外1管在35℃培养4小时,并将此培养物接种改良AE芽胞形成培养基中,最好用0.75mL经4小时培养的硫乙醇酸盐的培养基,接种到芽胞肉汤中,于35℃厌氧罐中,培养18-24小时。

      核对培养结果,用相差显微镜观察芽胞或作涂片染色镜检,显微镜视野中少于5个芽胞的认为芽胞形成不良。

      将芽胞形成培养物用10000×g转速15分钟离心,并将无细胞的芽胞培养物,以反向乳凝试剂盒,检测肠毒素。

    五、控制:

      适宜的冷却处理和再加热,食品加工人员的教育。 当产品达到合适温度时,那些未被杀死的芽胞可能发芽。蒸煮后需要经过快速统一的冷却,事实上在所有的爆发病例中,产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品,特别当食品量又是很大时。适当的热处理,充分的再加热,冷却食品,也是必要的控制措施。食品加工人员的教育仍是控制的一个关键方面。


    编辑:foodyy

     
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    关键词: 产气荚膜梭菌
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