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    出血性大肠菌及检验

    放大字体  缩小字体 发布日期:2010-05-11  浏览次数:2008
    核心提示:一、概况  肠出血性大肠杆菌(EHEC)是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。 

    一、概况

      肠出血性大肠杆菌(EHEC)是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。

      肠出血性大肠杆菌感染可引起轻度腹泻、出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合症(HUS),血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。其中HUS病程凶险,易造成急性肾衰竭乃至死亡。

      1982年美国首次报道了由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发。此后,世界各地陆续报道了该菌引起的感染,并有上升趋势。1996年在日本发生的EHEC O157:H7的暴发流行,引起出血性腹泻,先后波及30多个都、府、县,感染近万人,并造成12人死亡,引起了全世界的关注。此外,美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。日本、加拿大及瑞士等国已将EHEC O157:H7列为必须报告的传染病,予以高度重视。我国于1988年首次分离到EHEC O157:H7,从已有的流行病调查资料来看,我国亦存在EHEC的散发病例,但尚未有暴发流行的报道。

    二、流行病学

      EHEC O157:H7引起的感染有明显的季节性,多发生于夏秋两季,7-8月为发病高峰。在地区分布上,多发生于发达国家,主要以散发性感染为主。在年龄分布上,儿童与老年人的发病率明显高于其他年龄组,且并发HUS和TTP的机率较高。最易分离到 O157:H7的年龄为5-9岁(0.9%)和50-59岁(0.89%)。农场动物,尤其是反刍动物,构成EHEC O157:H7在世界范围内的主要贮存宿主。O157:H7在牛中的流行报告范围为0.1-16%;羊、猪、鸡、马、鹿、鸽子、海鸥等动物均可能为EHEC的携带者。EHEC的感染可形成直接传播(动物→人,人→人),也可以通过间接传播(食物、水源→人)。食源性的EHEC感染中,牛肉、生奶、鸡肉及其制品,蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中, 牛肉是最主要的传播载体。

      EHEC O157:H7的感染剂量极低。潜伏期为3-10天,病程2-9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻,数天后出现出血性腹泻,可发热或不发热。部分患者可发展为HUS、TTP等, 严重者可导致死亡。

    三、生物学特征

      EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性,无芽胞,有鞭毛,动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失,动力试验阴性,即O157:NM。EHEC O157:H7具有较强的耐酸性,pH2.5-3.0,37℃可耐受5小时;耐低温,能在冰箱内长期生存;在自然界的水中可存活数周至数月;不耐热,75℃ 1分钟即被灭活;对氯敏感,被1mg/L的余氯浓度杀灭。EHEC 的最适生长温度为33-42℃,37℃繁殖迅速,44-45℃生长不良,45.5℃停止生长。

      EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外,其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌 基本相似,但也有某些生化反应不完全一致,具有鉴别意义(详见表2)。EHEC O157:H7虽然有uidA基因,但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性,不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光,即MUG阴性。

      EHEC除其代表菌株O157:H7外,还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验;后者则应先进行动力试验,动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。

      EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素(VT),也称作类志贺氏毒素(SLT),是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合,具有毒素活性的A亚单位进入细胞,改变60s核糖体的组分,干扰蛋白质的合成。编码VT的基因位于噬菌体上,可缺失而不产生VT。

    四、EHEC O157:H7的检验

    1、培养基制备:

      改良EC新生霉素增菌肉汤 (mEC)

      EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素,使终浓度为20μg/mL。

      改良山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC)

      山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液,使终浓度2.5mg/L,头孢克污,使终浓度为0.05mg/L。

      MUG-LST肉汤

      LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使终浓度为0.1g/L。

    2、增菌培养

      秤取25克样品放入225mL mEC中,均质。于41±1℃培养18-24小时。

    3、分离

      将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4,10-5,10-6稀释度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,边缘光滑,呈淡褐色中心,直径约2mm。

    4、鉴定

      挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接种MUG-LST,于36±1℃培养18~24小时,出现产气,且无荧光者,分离到普通营养琼脂。

      对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验,必要时进行生化试验。

      在检测过程中,也可以在选择性增菌后,取出5mL增菌液,经100℃水浴15分钟灭活后,供自动酶联荧光免疫测试(VIDAS),迅速获得初步结果,阳性反应者需作进一步证实。

      EHEC O157:H7检验程序图解

    检样25g

          mEC225mL → VIDAS快速筛选

      ↓41±1℃,18-24h

    10-4,10-5,10-6稀释度涂布TC-SMAC

    ↓36±1℃,18-24h

    挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST

    ↓36±1℃,18-24h

    MUG阴性培养物转种普通营养琼脂

    ↓     ↓

    生化反应鉴定    血清凝集鉴定

           或

             胶乳凝集试验

      用上述方法在样品中分离获得的纯菌落,经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者,报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。

      如需要进一步检测Vero毒素基因的存在,可通过接种Vero细胞或Hela细胞,观察细胞病变进行判定,或可使用基因探针检测和聚合酶链反应(PCR)检测法。(参见FDA细菌分析手册第8版)

    表1:EHEC O157:H7部分生化反应特性

    靛基质(吲哚)试验

    阳性

    MR-VP试验

    MR阳性 VP阴性

    枸橼酸盐利用试验

    阴性

    氧化酶试验

    阴性

    三糖铁琼脂

    底及斜面黄色,H2S-

    纤维二糖发酵

    阴性

    山梨醇发酵

    阴性或迟缓发酵

    赖氨酸脱羧酶

    阳性(紫色)

    鸟氨酸脱羧酶

    阳性(紫色)

    棉子糖发酵

    阳性

    卫矛醇发酵

    阳性

    西蒙氏柠檬酸盐

    阴性

    鼠李糖发酵

    阳性

    MUG试验

    阴性

    动力试验

    有动力或无动力

     

    表2: EHEC O157:H7与大肠埃希氏菌有鉴别意义的生化特性

    试验项目

    E.coliO157:H7

    (174株)%

    大肠埃希氏菌

    (974株)%

    (1887株)%

    MUG

    0

    96

    NT

    山梨醇

    0

    95

    80

    棉子糖

    100

    20

    49

    卫矛醇

    100

    50

    49

    赖氨酸

    100

    92

    81

    鸟氨酸

    100

    74

    58

     

    [注] NT为未检测,表内数字为阳性率。

    五、控制

      适宜的蒸煮,适当的储存温度,个人卫生教育,防止粪便污染动物胴体是控制出血性大肠杆菌污染的主要措施。

    编辑:foodyy

     
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