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    沙门氏菌及检验

    放大字体  缩小字体 发布日期:2010-09-01  浏览次数:17711
    核心提示:  人沙门氏菌病有四类综合症:沙门氏菌病;伤寒;非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外

      人沙门氏菌病有四类综合症:沙门氏菌病;伤寒;非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致,通常表现为轻度,持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%,而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%,幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。

      非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致,能影响所有器官,有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。

    一、致病性

      沙门氏菌胃肠炎,潜伏期一般6-72小时,主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌,死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便,沙门氏菌常存在于动物中,特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水,土壤,昆虫中,从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中,包括生肉,禽,奶制品和蛋,鱼,虾和田鸡腿,酵母,椰子,酱油和沙拉调料,蛋糕粉,奶油夹心甜点,顶端配料,干明胶,花生露,橙汁,可可和巧克力。

      沙门氏菌属也是嗜温性细菌,在中等温度,中性pH,低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为0.94。兼性厌氧,对中等加热敏感。同样,该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染;蒸煮;巴氏消毒等控制。正常家庭烹调,个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染,以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。

    二、检验

      因沙门氏菌是最常见的食源性细菌病原体,因此在本节中重点介绍沙门氏菌的检验。沙门氏菌是食物传播病原菌中研究最活跃的细菌。从食品中分离和鉴定沙门氏菌,当前通用的方法学分5个步骤:

      1.前增菌-第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌,使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。

      2.选择性增菌-在含选择性抑制剂的促生长培养基中间,样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖,同时阻止大多数其他细菌的增殖。

      3.选择性平板分离-这一步采用固体选择性培养基,抑制非沙门氏菌的生长,提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。

      4.生物化学筛选-排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。

      5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。

      这五个步骤代表理想状况。不过一个有经验的检验员,可能在一个或几个步骤中看出特性和差别。

      目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础,25g食品为标准分析单位。

    三、从食品中分离沙门氏菌样品的制备

      下面的方法是以25g样品为检测单位,样品:肉汤为1∶9的比例。除非另有说明,根据混合程度,加足够的肉汤保持1∶9的比例。对不需准确称量检测的样品,例如:田鸡腿,可参看特定方法说明。

    1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液奶(去脂牛奶,含2%脂肪牛奶,全脂奶,和脱脂奶)、粉状调制食品(蛋糕,甜饼,炸面圈,饼干和面包)、婴儿食品、口食或软管进食含蛋的食品:

      检验前的冷冻样品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化以获取待检测部分,则尽可能迅速的解冻所需部分,使竞争菌数少增加或降低沙门氏菌的可能损伤。解冻需在45℃以下,有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2&#0;5℃,18小时内解冻。无菌操作称取25g样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500mL)或其他合适的容器内。非粉状的样品,加入225mL灭菌乳糖肉汤。如果制品是粉状,加入约15mL灭菌乳糖肉汤,用灭菌玻璃棒,匙或灭菌压舌器搅拌,使成均匀悬液。再加3份乳糖肉汤10mL,10mL,190mL,使总量为225mL。充分搅拌,直到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温静置60min。振摇使充分混匀,用试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后将瓶盖旋松约1/4圈,置35℃培养24±2小时。以下步骤按四,1-10进行。

    2、蛋类:

      A、含壳蛋:用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含0.1%十二烷酸磺酸钠(SDS)的200ppm氯离子溶液中浸泡30min。加8mL 5.25%次氯酸钠到含1g SDS的992mL蒸馏水中,制备200ppm cl-/0.1%SDS溶液。这种消毒剂需在使用前临时制备。无菌操作打开蛋,使用灭菌的蛋分离器,弃去蛋白。无菌操作称取25g蛋黄到灭菌的500mL锥型瓶或其他合适容器内。加225mL胰胳胨(胰化物)大豆肉汤(TSB),并振荡充分混匀。在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2,置35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

      B、液全蛋(均状):无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中。加225mLTSB并振荡充分混匀。按上面所述继续。

      C、煮硬的蛋(鸡蛋,鸭蛋或其他蛋类):目前,不知道蛋白中的沙门氏菌抑制因子是否具有热稳定性。因此,无菌操作分离蛋白和蛋黄。称取25g粉状蛋黄固体到无菌500mL锥型瓶或其他合适容器中。加225mLTSB并旋转充分混匀。按上面所述继续。

    3、脱脂乳粉

      A、速溶:无菌操作称取25g样品,加入灭菌烧杯(250mL)或其它合适容器内。经灭菌玻璃或纸质(用带卷好以备高压灭菌)漏斗,往灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中(装有225mL煌绿水),缓缓倾注25g检测单位,使其覆盖在煌绿水表面。也可将多份25g检验单位按比例 倒入相应份数的煌绿水表面。按每1000mL灭菌蒸馏水中加1%煌绿溶液2mL配置煌绿水。将盛有样品&#0;前增菌培养基的容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖,不需要混合或调节pH值,于35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

      B、非速溶:按上述A脱脂乳粉的方法进行,只不过不允许将多份检验单位按比例合并检验。

    4、全脂奶粉:

      无菌操作称取25g样品,加入无菌的,带螺旋帽的广口瓶中(500mL)或其他合适的容器内。加入225mL灭菌蒸馏水并振荡充分混匀。盖紧在室温下静置60分钟。使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。然后加0.45mL1%的煌绿染液并充分混匀。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

    5、酪蛋白:

      无菌操作称取25g样品,加入无菌均质杯中,加225mL灭菌乳糖肉汤到样品中并匀质2分钟。无菌操作,把已匀质的混合物转移到灭菌,带螺旋帽的500mL广口瓶或其他合适的容器内。盖紧盖子在室温下静置60分钟。振摇使充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。旋松瓶盖约1/4圈后,置35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

    6、大豆粉:

      无菌操作称取25g样品,加入灭菌烧杯(250mL)或其它合适容器内。用灭菌玻璃或纸质(用带卷好以备高压灭菌)漏斗,往装有225mL乳糖肉汤的灭菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中,缓缓倾注25g检测单位,使其覆盖在乳糖肉汤表面。检测单位(25g)不可多份按比例混合检测。容器静置60±5分钟。松松地盖上容器盖,不需要混合或调节pH值,于35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

    7、含蛋制品(面条,蛋卷,通心粉,意大利面条)、干酪、生面团、调制色拉(火腿,蛋,鸡肉,金枪鱼,火鸡)、新鲜的、冷冻的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲壳类动物(小虾,蟹,小龙虾,LANGOSTINOS,龙虾)和鱼:

      检测前冷冻样品最好不要解冻,如果冷冻样品必须软化以取其检测部分,则要在持续搅拌并带有自动调温器控制的45℃水浴内15分钟内解冻。或者在2&#0;5℃18小时内进行。

      无菌操作称取25g样品,加入灭菌的均质器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤并均质2分钟。再无菌操作转移已均质的混合物到无菌的带螺旋帽的广口瓶中(500mL)或其他合适的容器内。盖紧瓶盖,于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。充分混匀。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时,以下步骤按四,1-10继续。

    8、干酵母:

      无菌操作称取25g样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500mL),或其他合适的容器内。加入225mL灭菌胰酪胨(胰化)大豆肉汤,充分混匀使酵母形成均匀悬液。盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时,调节pH值至6.8±0.2,在测定最终pH前要混合充分。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时。非活性干酵母,以下步骤按D,1-11进行。活性干酵母,混匀经培养过的样品,转种1mL到10mL月桂基蛋白(LST)中,另转种1mL到10mL四磺酸盐(TT)肉汤中。将此两种选择性肉汤于35℃培养24±2小时。充分地旋转混合经培养过的增菌肉汤,每种肉汤都要用3mm接种环划线接种3个选择性平板(四,3和四,4),接下面的四,5&#0;10进行。

    9、食品上霜和上顶用的混合物:

      无菌操作称取25g样品,放入灭菌,带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入225mL营养肉汤并充分混合。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时,调节pH值至6.8±0.2。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时。以下步骤按四,1-10继续。

    10、调味品:

      A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、红辣椒、欧芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片:无菌操作称取25g样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。加入225mL灭菌胰酪胨大豆(TSB)肉汤,充分混匀,盖紧瓶盖于在室温下静置60分钟。旋动混匀,用试纸测定pH值。必要时,调节pH值至6.8±0.2。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时。以下步骤按四,1-10继续。

      B、洋葱片、洋葱粉、大蒜片:无菌操作称取25g样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶或其他合适的容器中。将样品于含K2SO3的TSB胰酪胨大豆肉汤(1000mLTSB加5g K2SO3使K2SO3的最终的浓度为0.5%)中进行前增菌。添加K2SO3于肉汤中。分装225mL于500mL锥形瓶中,经121℃高压灭菌15分钟。灭菌后无菌操作测定容量,必要时再调整至225mL。将225mL含K2SO3的无菌TSB加入样品中,充分混匀。接下去按三,10A节进行。

      C、牙买加胡椒、桂皮、丁香及薄荷:目前还没有方法可以中和这四种香料的毒性。将香料稀释至无毒的程度,再进行菌检。检验牙买加胡椒,桂皮和薄荷时,样品与肉汤比例为1∶100,而丁麝香样品与肉汤比例为1∶1000。检查叶状的调味品,因遇到脱水的制品,可吸收肉汤这一实际困难,其样品与肉汤比例要大于1∶10。检查这些调味品按三,10A描述的方法进行,保持推荐的样品与肉汤的比例。

    11、糖果与糖衣(包括巧克力):

      无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌容器中。加入225mL灭菌的调配脱脂乳粉,搅拌2分钟。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。再加入0.45mL1%煌绿染液混匀,将瓶盖旋松1/4转后培养。以下按四,1&#0;10节进行。

    12、椰子:

      无菌操作称取25g样品放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤,振摇后,盖紧瓶盖在室温下静置60分钟,再振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过(15分钟)的阴离子特吉托尔7号,并充分混匀。可用已蒸过(15分钟)的三硝基甲苯X&#0;100来代替。这些表面活性剂限制使用最小量,使之刚刚起泡沫即可。三硝基甲苯X&#0;100大约2或3滴。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时。以下步骤按四,1-10继续。

    13、食用染料与食用色素:

     pH6.0或以上的染料(10%悬浮液),按上述干全蛋方法(C&#0;1)处理。沉淀染料或pH低于6.0的染料,无菌操作称取25g样品,放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL不含煌绿染料的四硫磺酸盐肉汤混匀。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟,用pH计调节pH值至6.8±0.2。再加入2.25mL0.1%的煌绿溶液,充分旋动混匀。旋松瓶盖约1/4转后,置35℃培养24±2小时。接下去按下面的四,3&#0;10节进行。

    14、明胶:

      无菌操作称取25g样品,放入灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。加入225mL灭菌的乳糖肉汤和5mL5%明胶酶水溶液。混合均匀,盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。转动混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。将瓶盖旋松1/4转,置35℃培养24±2小时。以下按四,1&#0;10节进行。

    15、肉、肉代用品、肉副产品、动物产品、腺体制品和粗粉(鱼,肉,骨):

      无菌操作称取25g样品放入灭菌的搅拌器中。加入225mL灭菌的乳糖肉汤,搅拌2分钟。再无菌操作转移已搅拌的混合物到灭菌的带螺旋帽的500mL广口瓶中或其他合适的容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。如果混合物为粉状,研磨过或已粉碎的,则不用搅拌。不需要搅拌的样品,加入乳糖肉汤,并充分混匀;盖紧瓶盖在室温下静置60分钟。旋动使充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2。总计加入2.25mL已蒸过(15分钟)的特吉托尔阴离子7号,混匀。也可用已蒸过(15分钟)的三硝基甲苯X&#0;100来代替。控制使用这些表面活性剂剂量,刚刚起泡沫即可。实际用量取决于试验材料的成分;分析粉状腺体制品,不需要用表面活性剂。将瓶盖旋松1/4转后,将样品混合物置35℃培养24±2小时。以下按四,1&#0;10节进行。

    16、田鸡腿(此方法用于国内的和国外的所有田鸡腿检验):

      将15对田鸡腿放入灭菌塑料袋内,并用灭菌乳糖肉汤浸没。如果单个腿估计平均重在25g或以上,则只需检查15对的每对中的一条腿。把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中,在机械荡器上震荡15min,以4cm(1-1/2in)机械振荡100次/分钟。从袋中倾倒出乳糖肉汤于另一个灭菌塑料袋内。加更多的乳糖肉汤,使总量为3500mL。充分混匀,于室温下静置60分钟。必要时调节pH值至6.8±0.2。再把装有乳糖肉汤的塑料袋放入塑料烧杯或其它合适的容器内,于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四,1&#0;10节进行。

    17、野兔骨架(此方法用于国内的和国外的所有的野兔骨架):

      取3只野兔骨架放入灭菌塑料袋内,并用灭菌乳糖肉汤浸没(见上述A,23&#0;25节),把袋放入大塑料烧杯内或其它合适的容器中,在机械震荡器上以4cm(1-1/2in)幅度振荡100次/分钟,震荡15min。从袋中倾倒出乳糖肉汤混合物于另一个灭菌塑料袋内,加更多的乳糖肉汤,使总量为3500mL。充分混匀,于室温静置60分钟。必要时用pH试纸调置6.8±0.2,于35℃培养24±2小时。接下去按下面的四,1&#0;10节进行。

    18、口香糖:

      无菌操作称取25g样品到灭菌烧杯(250mL)或其他合适容器中。制备过滤除菌的1.0%纤维素酶溶液(加1g纤维素酶到99mL无菌水中),用0.45um膜过滤除菌,置于150mL瓶中。(纤维素酶溶液在2·-5℃可保存最长2周时间)。加入225mL无菌乳糖肉汤和2.25mL无菌1%纤维素酶溶液于500mL无菌带螺旋盖的广口瓶或其他合适容器。用磁力搅拌器剧烈搅拌酶/肉汤混合物时,通过无菌玻璃漏斗迅速倒入25g待检样品。旋好瓶盖,室温下静置60分钟,无须调pH值。旋松瓶盖,35℃培养24±2小时。以下按四进行。

    四、沙门氏菌的分离

      1、拧紧瓶盖并轻轻振荡培养过的样品混合物。

      生鲜食物、严重污染的食品和动物饲料:

      转移0.1mL混合物到10mLRAPPAPORT&#0;VASSILIADIS(RV)肉汤培养基中,另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤(TT)中。

      其它食品:

      转移1mL混合物到10mL亚硒酸盐胱氨酸肉汤(SC)中,另转移1mL混合物到10mL四硫磺酸盐肉汤(TT)中。

      2、选择性增菌按如下步骤进行:

      生鲜食品、严重污染的食品和动物饲料:

      RV培养基在42±0.2℃(水溶)中培养24±2小时。TT肉汤在43±0.2℃(水溶)中培养24±2小时。

      其它食品:

      SC和TT肉汤在35℃培养24±2小时。

      3、混合均匀(如果是试管,涡旋式混合),用3mm直径的接种环,满环(10μl)划线接种TT肉汤于亚硫酸铋(BS)琼脂,木糖赖氨酸去氧胆酸盐(XLD)琼脂和HEKTOEN氏肠道菌(HE)琼脂平板上。BS琼脂平板于划线接种的前一天制备好储存在室温暗处。

      4、再用3mm直径的接种环, 从RV培养基(样品为生鲜食物,严重污染的食品和动物饲料)和SC肉汤(除了生鲜食物,严重污染的食品和动物饲料以外其它样品)取满环(10μl),划线接种于上述平板上。

      5、把选择性平板置35℃培养24±2小时。

      6、检查平板中可疑沙门氏菌菌落的存在。

      典型的沙门氏菌菌落形态:

      从每个经过24±2小时培养后选择性平板上挑 取2个或更多个菌落。典型的沙门氏菌菌落如下:

      A、在HEKTOEN氏肠道菌(HE)琼脂上。

      菌落呈兰绿至兰色,带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的光泽黑色中心或几乎全部黑色的菌落。

      B、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐(XLD)琼脂上。

      粉色菌落,带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可有大的光泽黑色中心或呈几乎全部黑色的菌落。

      C、亚硫酸铋(BS)琼脂上。

      呈褐色,灰色或黑色,有时带有金属光泽。菌落周围的培养基通常开始呈褐色,但伴随培养时间的延长而变为黑色,并有所谓的晕环效应。

      如果典型菌落出现在经24±2小时培养后的BS琼脂上,则挑取2个或更多个典型菌落。不论BS琼脂平板在培养24±2小时时是否挑取过菌落,BS平板再培养24±2小时。培养了48±2小时后,如果BS平板上出现典型菌,则挑取2个或更多个菌落,如果只在经过24±2小时培养的BS平板上挑取了菌落,接种到三糖铁琼脂(TSI)和赖氨酸琼脂(LIA)上,会呈现非典型反应以至视为培养物中不存在沙门氏菌 。参见下面四.8部分和四.9部分,有关TSI和LIA反应的详细描述。

      非典型的沙门氏菌菌落形态:

      不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时,按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。

      A、HE和XLD琼脂:

      非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落,带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2小时培养后,没有典型的沙门氏菌菌落,则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。

      B、BS琼脂:

      某些非典型菌株产生绿色菌落,其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2小时后,没有出现典型菌落,则不挑取任何菌落,让平板继续培养24±2小时。如果经48±2小时培养后,仍没有典型或可疑的菌落出现,则挑取2个或更多个非典型的菌落。

      7、用灭菌接种针轻轻地接触每个菌落中心部位,接种TSI斜面,先在斜面上划线,再于底层穿刺。不需灼烧接种针,即可接种LIA斜面,先穿刺接种底层两次,再划线斜面上。由于赖氨酸脱羧反应需严格厌氧条件,因而LIA斜面必须有深的底层(4cm)。将已挑过菌落的选择性平板于5&#0;8℃储存。

      8、将TSI和LIA琼脂斜面于35℃分别培养24±2小时。当进行斜面培养时放松试管帽以保持需氧条件,以防止过量的H2S产生。

      在TSI琼脂中,典型的沙门氏菌培养物使斜面呈碱性(红色),底层呈酸性(黄色),产生或不产生H2S(琼脂变黑色)。在LIA琼脂中,典型的沙门氏菌培养物其试管底层呈碱性(紫色)反应。只有试管底层呈明显黄色时才认为有酸性(阴性)反应。不要单纯根据其试管底层产生的褪色反应就排除它。在LIA中,大多数沙门氏菌培养物皆产生H2S;一些非沙门氏菌培养物产生砖红色反应。

      9、在LIA琼脂上所有底层呈碱性反应的培养物,无论其在TSI琼脂上反应如何,皆应全部保留为可疑的沙门氏菌分离物,并进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层反应和在TSI中呈斜面碱性,底层酸性的培养物,均视为可疑的沙门氏菌分离物,应进一步做生化和血清学试验。在LIA中呈酸性底层和在TSI中呈酸性斜面和酸性底层的培养物,可视为非沙门氏菌培养物而弃去。对所保留的拟定阳性TIS琼脂培养物,可按下面四,10节叙述的进行检测,是否为沙门氏菌,包括亚利桑那沙门氏菌。如果TSI中培养物没有呈现沙门氏菌的典型反应(斜面碱性,底层酸性),再从未拟定阳性的选择性平板上另外挑取可疑菌落,象上面四,7节所述的接种TSI和LIA斜面。

      10、生化和血清学鉴定试验:

      a从亚硒酸盐胱氨酸肉汤(或相应食品的RV培养基)划线分离的选择性琼脂平板上所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物和从四硫磺酸盐肉汤划线分离的选择性平板所挑取的3个拟定阳性TSI琼脂培养物,进行生化和血清学鉴定试验。

      b如从一组选择性琼脂平板未分离出3个拟定阳性的TSI琼脂培养物,则对其它已分离到的拟定阳性的TSI琼脂培养物进行生化和血清学鉴定试验。对所分析的每个25g样品,至少应检查6个TSI培养物。

    五、沙门氏菌的鉴定:

      1、混杂培养物:

      对呈混杂菌的TSI琼脂培养物,皆应划线接种于麦康凯(MC)琼脂,HE琼脂,或木糖赖氨酸去氧胆酸盐(XLD)琼脂上,于35℃培养24±2小时。检查平板上可疑沙门氏菌存在与否。

      a、在麦康凯(MC)琼脂上:

      典型菌落呈透明、无色,有时带有暗色中心。沙门氏菌菌落有时可使培养基中其它细菌所造成的胆盐沉淀区透明。

      b、在Hektoen氏肠道菌(HE)琼脂上:见上述四,6a。

      c、在木糖赖氨酸去氧胆酸盐(XLD)琼脂上:见上述四,6b。

      按上面的四,6节所述转种至少2个可疑沙门氏菌菌落到TSI琼脂和LIA琼脂斜面上,接下去按上述的四,8节进行鉴定。

      2、纯培养物:

      a、尿素酶试验(常规)。由每个拟定阳性TSI琼脂斜面培养物,用灭菌针分别接种生长物到每个尿素肉汤试管中。偶尔也会有未接种的尿素肉汤管变紫红色(试验阳性),因而应包括未接种该肉汤管作为对照,于35℃培养24±2小时。

      b、可选的尿素酶试验(快速法)。用3mm直径接种环,自每一拟定阳性的TSI琼脂斜面培养物中取2环转种到快速尿素肉汤管中,37±0.5℃水浴中培养2小时。弃去所有呈阳性结果的培养物,保留所有阴性反应的(培养基不变色)培养物,为进一步研究试验用。

      3、血清学多价鞭毛(H)试验:

      a、此时或以后进行多价鞭毛(H)试验,可按下面五,4节所述进行。从每个尿素酶阴性的TSI琼脂斜面培养物接种到以下任一项, 1)脑心浸液肉汤,于35℃培养4&#0;6小时,直到可见的生长物出现(供当日试验用),或2)胰胳胨大豆肉汤,于35℃培养24±2小时(供次日试验用)。在各5mL肉汤培养物中加2.5mL甲醛生理盐水溶液。

      b、选两个以甲醛处理的肉汤培养物同沙门氏菌多价鞭毛(H)抗血清试验。在10×75mm或13×100mm血清学试管内,加入0.5mL经合适稀释的沙门氏菌多价鞭毛(H)抗血清,再加入0.5mL待测抗原进行试验。并以0.5mL甲醛生理盐水溶液同0.5mL甲醛处理的抗原混合好,制成盐水对照,将各混合物于48&#0;50℃水浴培养,每隔15分钟观察一次初步结果,并于1小时读数最终结果。

      阳性反应:在甲醛肉汤培养物与血清混合物中凝集,而在甲醛肉汤培养物与甲醛盐水管中(对照管)不凝集。

      阴性反应:在甲醛肉汤培养物与血清混合物中(试验混合物)不凝集,在对照管中也不凝集。

      非特异反应:在试验混合物与对照管中皆出现凝集。对出现这类结果的培养物,需用“Spicer Edwars”氏抗血清做进一步试验。

      4、尿素酶阴性培养物试验:

      a、赖氨酸脱羧酶肉汤。如果所做的LIA试验是满意的,则不需重复试验。如果培养物呈现可疑的LIA反应,则以赖氨酸脱羧酶肉汤进行赖氨酸脱羧酶的最终鉴定。将少量可疑沙门氏菌阳性TSI琼脂斜面培养物接种至赖氨酸脱羧酶肉汤管。将试管帽旋紧,置于35℃培养48±2小时,至少每隔24小时检查一次。沙门氏菌因碱性反应,则使整个培养基呈紫色。阴性反应则使整个培养基呈黄色。如果培养基出现褪色现象(即不呈紫色也不呈黄色),可加入几滴0.2%溴甲酚紫溶液,然后再观察试管的反应。

      b、酚红卫茅醇肉汤或含有0.5%卫茅醇的紫色肉汤基础液。由TSI琼脂上取少量培养物接种至肉汤管中。将试管帽放松。置于35℃培养48±2小时,但24h后观察反应。大多数沙门氏菌呈阳性实验结果,表现为内部发酵管中产气和培养基变酸(黄色)。产酸为阳性反应。阴性反应为倒管内无气体产生。整个培养基呈红色(有酚红指示剂)或紫色(有溴甲酚紫指示剂)。

      c、胰蛋白胨(或色氨酸)肉汤。将少量TSI琼脂培养物接种到肉汤管中,置35℃培养24±2小时,并按以下进行试验。

      1)氰化钾(KCN)肉汤。

      从24h色氨酸培养物移取3mm接种环一环转种到KCN肉汤管中。将管口加热,以便加塞时蜡封良好。35℃培养48±2小时,但24h后观察反应。有生长者(有浑浊)为阳性。大多数沙门氏菌在此培养基中不能生长,即无浑浊现象。

      2)丙二酸盐肉汤:

      用3mm接种环移取24h色氨酸肉汤培养物,转种到丙二酸盐肉汤管中。因偶尔会出现未接种的丙二酸盐肉汤在存放期间变兰(阳性反应),所以应有未接种的丙二酸盐肉汤管作对照。35℃培养48±2小时,但在培养24h后观察反应。大多数沙门氏菌培养物在此肉汤中为阴性反应(绿色或不变色)。

      3)吲哚试验:

      转种5mL24h色氨酸肉汤培养物到空试管中,加入0.2-0.3mLKovacs氏试剂,大多数沙门氏菌培养物为阴性反应(在肉汤表面无深红色)。并记录呈桔色和粉色变化的中间型为±反应。

      4)沙门氏菌血清学鞭毛(H)试验:

      如果未做多价鞭毛(H)试验或Spicer-Edwards氏鞭毛(H)试验,可任选其一。

      5)吲哚试验阳性和血清学鞭毛(H)试验阴性;或者KCN试验阳性和赖氨酸脱羧酶试验阴性的非沙门氏菌任一培养物予以去除。

      5、沙门氏菌血清学菌体(O)试验。(用已知沙门氏菌培养物同所有抗血清做予试验)。

      a、多价菌体(O)试验:

      用蜡笔在每个玻璃或塑料平板(15×100mm)内侧划出2个约1×2cm的区域。可使用商品化的分区载玻片,用2mL0.85%生理盐水乳化从24-48hTSI斜面或者更好是胰胨血琼脂基础(无血),用3mm接种环移取培养物。加1滴菌悬液于用蜡笔标出的每一矩形区域的上部。这一区域的下部加1滴生理盐水。在另一区域加1滴沙门氏菌多价菌体(O)抗血清。再以干净灭菌的接种环或针将一个区域内的菌悬液和生理盐水混合。在另一区域内菌悬液和抗血清液混合。将混合液前后倾斜移动1min,并在良好照明下对着黑暗背景观察,任何程度的凝集都视为阳性反应。多价菌体(O)试验结果分类如下:

      阳性反应:混合物试验凝集,而在盐水对照中不凝集。

      阴性反应:混合物试验不凝集,在盐水对照中也不凝集。

      非特异性反应:混合物试验和盐水对照中皆凝集,需按Edwards和Ewing氏的肠杆菌科鉴定中所描述的进一步作生化学和血清学试验。

      b、菌体(O)群试验

      如有各群菌体(O)抗血清,包括Vi,代替沙门氏菌多价菌体(O)抗血清,按上述五,5a试验。对Vi凝集反应阳性的可参照官方分析分析方法的967.28B部分专门处理这些培养物。与菌体(O)群抗血清呈阳性凝集的培养物,作该菌体(O)群阳性记录;不能与菌体(O)群抗血清发生反应者,做该菌体(O)群试验阴性记录。

      6、补充生化试验

      按表1中1-11项试验,对培养物呈典型沙门氏菌反应者,进行沙门氏菌分类。如在25g分析样品中有一个TSI培养物被划为沙门氏菌,则该25g分析样品的其他TSI培养物就无需进一步试验。沙门氏菌鞭毛(H)试验阳性表明有沙门氏菌抗原,但不具有沙门氏菌生化特性者,应对培养物作纯分离(按上述五、1),按上述五、2开始重新做试验。

      对表1中1-11项目,不呈典型沙门氏菌反应的培养物做以下补充试验以最终判断为非沙门氏菌。

      a、酚红乳糖肉汤或紫色乳糖肉汤。

      1)从每个尚未分类的24-48hTSI琼脂斜面上挑取少许培养物,接种到肉汤管中,35℃培养48±2h。并在24h后开始观察变化。

      阳性反应:产酸(黄色)和在倒立发酵管内产气。只要产酸就视为阳性反应。大多数沙门氏菌为阴性结果。即在倒立发酵管内没有气体形成,和整个培养基呈红色(含酚红指示剂)或紫色(含溴甲酚紫指示剂)。

      2)除培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应,或丙二酸盐肉汤试验呈阳性的培养物外,弃去乳糖试验阳性的非沙门氏菌培养物。为了证明他们是否为亚利桑那菌,需对这些培养物作进一步试验。

      b、酚红蔗糖肉汤或紫色蔗糖肉汤。

      按上述五,6a-1所叙述的程序进行,除那些培养物在TSI琼脂斜面上产酸和在LIA中呈阳性反应者外,呈蔗糖试验阳性结果者皆作为非沙门氏菌弃去。

      c、MR-VP肉汤。

      对每个未分类的TSI琼脂斜面上可疑沙门氏菌培养物,挑取少许,接种到此肉汤管中,置于35℃培养48±2h。

      1)在室温下按下述进行Voges-Proskauer氏(VP)试验:

      移取1mL48h培养物于试管中,并将剩余的MR-VP肉汤于35℃再培养48h。加入0.6mLα-萘酚溶液于试管中并振摇;加40%KOH溶液0.2mL,并振摇。为了加快反应速度,加少许肌酸结晶。4h后观察结果:阳性反应为整个培养基由粉红色转变至红宝石色。绝大多数沙门氏菌VP试验阴性,即整个肉汤不呈粉红至红色变化。

      2)甲基红试验:

      吸取经96h培养的MR-VP肉汤5mL于试管中,加入5-6滴甲基红指示剂,立即观察结果。绝大多数沙门氏菌培养物呈阳性结果,即培养基呈弥散性红色。明显的黄色为阴性结果。对KCN阳性,V-P试验阳性及甲基红试验为阴性培养物,皆可作为非沙门氏菌弃去。

      d、Simmons氏枸橼酸盐琼脂:

      从未分类的TSI琼脂斜面上,用接种针沾取培养物,划线接种于枸橼酸盐琼脂斜面上,并穿刺底层。置于35℃培养96±2h,按下述方法读取结果。

      阳性反应:能生长,通常伴随颜色由绿色变兰色。大多数沙门氏菌培养物为枸橼酸盐阳性。

      阴性反应:不生长或微弱生长,而且不变色。

      7、培养物的分类:

      沙门氏菌培养物应具有表1反应模式。凡培养物具有表2所列任何一小项结果,为非沙门氏菌则弃去。对任何培养物,当不能按表1的分类表,明确地鉴定为非沙门氏菌属,或也不能根据表2所列试验反应从沙门氏菌属中排除者,可按Edwards和Ewings氏的“肠杆菌科鉴定”所述的补充试验进一步分类。

      如2个TSI培养物皆不能按生化试验证实分离物为沙门氏菌时,则对同一个25g检验样品中保留的尿素酶阴性TSI培养物,按五,4开始进行生化学试验。

      8、沙门氏菌属的拟定性鉴定。

      使用5种商品化的生物化学试剂盒(API 20E, Enterotube II, Enterobacter aceae II, MICRO-ID,或Vitek GNI)中任一种,代替常规的生化管系统,鉴定拟定食源性沙门氏菌属。按本节鉴定所述,检验人员根据自己试验室选择商品试剂盒与生化管系统相适应的一种商品试剂盒。生化学商品试剂盒不能用来代替血清学试验(1)。组装试剂盒,配制试剂盒所需试剂。参照官方分析方法的978.24部分(API-20E, Enterotube II和Enterobacterlaceae II),989.12部分(MICRO-ID),和991.13部分(Vitek GNI),接种于每个组合,并按规定的时间与温度进行培养。加试剂,观察与记录结果。参照上述Ref.1把培养物拟定为沙门氏菌或非沙门氏菌属。 

      为证实拟定为沙门氏菌的培养物,尚需进行沙门氏菌菌体(O)血清学试验,按上述五,5;和沙门氏菌鞭毛(H)血清试验,按上述五,3;或进行Spicer-Edwards氏鞭毛(H)试验。并按下列原则对培养物进行分类:

      a、用商品化试剂盒拟定为沙门氏菌的培养物,若沙门氏菌菌体(O)血清学试验阳性与沙门氏菌鞭毛(H)血清学试验阳性的则报告为沙门氏菌。

      b、用商品化试剂盒确定为非沙门氏菌的培养物,参照AOAC标准(1)确定亦为非沙门氏菌,应作非沙门氏菌予以排除。

      c、凡不符合a或b的培养物,应按上述五,2-6项中有关规定作进一步试验,或按Ewing(2)氏的有关项目进一步试验,或送至标准定型实验室,做最后的血清定型与鉴定。

      9、鞭毛(H)试验阴性培养物的处理:

      对一些生化反应典型,被认为是沙门氏菌,但鞭毛(H)试验阴性的培养物,可能是无动力的菌株,或鞭毛抗原发育不充分,对此培养物的动力测定方法如下:

      从TSI斜面上挑取少量的培养物,接种于动力试验培养基平板中,在距平板边缘10mm处一次穿刺2-3mm深,不要刺到平板底或接种到其他任何部位。置于35℃培养24h。如果细菌游散生长至40mm或更远,按下述方法再试验:在游散生长最远处,用3mm接种环转种一环培养物至胰酪胨大豆蛋白胨肉汤中。重复沙门氏菌多价鞭毛(H)(按上述五,3)或作Spicer-Edwards氏鞭毛(H)血清学试验。如果培养物经第一个24h培养后无动力,于35℃培养24h;如果仍无动力,则置25℃再培养5天。如果上述试验仍为阴性,把该培养物定为无动力菌株。如果鞭毛(H)阴性培养物,按生化学反应可疑为沙门氏菌,应将培养物呈送微生物学实验室作进一步的鉴定和/或血清学分型。递送血清学定型培养物,除非另有说明,每个检验样品要递送两个分离物。培养物要放在脑心浸液琼脂斜面的试管内递送。试管的螺旋帽应拧紧以确保安全。

    六、控制:

      严格执行食品生产良好操作程序,注意灭蝇,加强对饮水、食品等的卫生监督管理,以切断传染途径。对食品加工和饮食服务人员定期进行健康检查,及时发现带菌者并给以治疗或调离工作岗位。加强屠宰业的卫生监督及各种食品特别是肉类运输、加工、冷藏等方面的卫生措施,防止沙门氏菌污染。

      在食品加工过程中,必须严格按卫生规范防止二次污染,通过蒸煮、巴氏消毒、存放适宜温度等进行控制,都能防止沙门氏菌病的发生。

    编辑:foodyy

     
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    关键词: 沙门氏菌
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